ChIP 与 R-ChIP：染色质与 RNA-DNA 互作研究的核心技术

在生命科学研究中，基因表达调控的分子机制一直是探索的热点。

染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）和 R-ChIP（RNA-DNA Hybrid Immunoprecipitation）作为两种关键技术，分别从 DNA - 蛋白质和 RNA-DNA 互作层面揭示了表观遗传调控的奥秘。

本文将系统介绍这两项技术原理、应用场景、实验流程及注意事项，并探讨纳米抗体技术对其性能的革新。

技术原理：从 DNA 到 RNA-DNA 互作的精准捕获

1. ChIP：解码蛋白质 - DNA 的动态对话

ChIP技术通过精准的分子捕获策略解析蛋白质与DNA的动态结合，其核心原理基于三个关键环节：

（1）动态互作的化学固定

· 交联机制：1%甲醛介导的氨基共价交联（-CH2-桥）可瞬时固定蛋白质-DNA复合物（如转录因子结合事件）。交联时间需根据样本类型优化：哺乳动物细胞（10-15分钟）、植物原生质体（20分钟）、组织样本（延长至30分钟）。

· 终止控制：甘氨酸通过竞争游离甲醛终止反应，避免过度交联导致的染色质凝聚（交联效率可通过SDS-PAGE检测组蛋白-DNA交联程度验证）。

（2）染色质拓扑结构的可控解离

· 机械剪切：超声破碎（Bioruptor系统）采用高频声波（20 kHz）在冰水浴中产生空化效应，将染色质片段化为200-1000 bp。关键参数：细胞密度（1×10^7/ml）、缓冲液离子强度（Triton X-100浓度0.1%-1%）、脉冲周期（30秒开/30秒关，循环15次）。

· 酶切策略：微球菌核酸酶（MNase）优先切割连接组蛋白的linker DNA，获得单核小体级分辨率（~147 bp）。适用于组蛋白修饰研究，需通过琼脂糖电泳监控消化程度。

（3）抗原-抗体的特异性识别· 表位识别窗口：抗体需识别交联后构象表位，例如针对组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）的特异性抗体可精准结合修饰后的组蛋白尾部。

· 纳米抗体革新：单域抗体（如VHH片段）凭借15 kDa小分子量可穿透交联网络，结合效率较传统IgG提升3倍（HUABIO数据）。

2. R-ChIP：捕捉 RNA-DNA 杂合体的基因组足迹

R-ChIP 主要用于研究 RNA-DNA 杂交体（R-loop）的分布与功能，其原理与 ChIP 类似，但针对 RNA-DNA 互作进行了优化：

· RNaseH1 介导的捕获：表达催化失活的 RNaseH1（RHΔ），其保留结合 RNA-DNA 杂合链的能力但不降解 RNA。RHΔ 的突变位点（如 D10A 和 E48A）需通过定点突变技术构建，并通过酶活性检测验证其催化功能完全丧失。

· 免疫沉淀与测序：通过抗标签抗体（如抗 FLAG）沉淀 RHΔ-R-loop 复合物，构建链特异性文库进行测序。R-ChIP 的优势在于其高分辨率（约 200 bp）和特异性，可通过阴性对照（如 RHΔ 双突变体）排除非特异性结合。

应用场景：解析基因调控的多维度工具

1. ChIP 的核心应用

· 转录因子结合分析：通过 ChIP-seq 鉴定转录因子在基因组上的结合位点，结合 RNA-seq 数据可构建基因调控网络。例如，在胚胎干细胞分化研究中，ChIP-seq 揭示了 GATA6 通过调控染色质可及性决定内胚层命运的机制。

· 组蛋白修饰研究：分析组蛋白乙酰化、甲基化等修饰在染色质上的分布，关联基因活性状态。例如，H3K4me3 标记活跃启动子，而 H3K9me3 与异染色质相关。

· 表观遗传药物开发：筛选靶向表观遗传酶的小分子化合物，评估其对染色质状态的影响。例如，DNA 甲基转移酶抑制剂 Guadecitabine 通过 ChIP-seq 被证实可下调 FGFR4 表达，抑制肺泡横纹肌肉瘤的生长。

2. R-ChIP 的独特价值

· R-loop 功能研究：R-loop 在转录调控、DNA 损伤修复及基因组稳定性中起关键作用。陈亮课题组利用 R-ChIP 发现 RNA 聚合酶停滞是 R-loop 形成的重要原因，并揭示了 GC 含量和 DNA 二级结构对 R-loop 动态变化的影响。

· 疾病机制探索：R-loop 异常与癌症、神经退行性疾病相关。例如，在骨髓增生异常综合症（MDS）中，R-ChIP 发现剪接因子突变导致造血干细胞 R-loop 水平紊乱，影响基因组稳定性。

· RNA 加工与稳定性：结合 RNA-seq，研究 R-loop 对 RNA 剪接、转运及降解的影响。例如，R-ChIP 揭示了 R-loop 在 mRNA 3' 端加工中的作用。

实验流程：从样本处理到数据分析的标准化操作

ChIP 实验流程

1. 交联

使用甲醛等交联剂处理细胞或组织，让蛋白质与 DNA 之间形成共价键，稳定它们之间的相互作用，将蛋白质 - DNA 复合物固定下来，即便短暂的相互作用也能被捕获。例如，对于哺乳动物细胞，常使用 1% 甲醛在室温下交联 10 - 15 分钟，之后加入甘氨酸终止交联反应。

2. 细胞裂解

通过去污剂溶液溶解细胞膜，使交联的蛋白 - DNA 复合物从细胞或组织中释放到溶液里。此步骤可去除胞浆蛋白，降低背景信号，提高实验灵敏度。通常不建议机械裂解细胞，可使用如 Thermo Scientific Pierce 染色质制备模块等试剂，分离核组分与其他细胞成分。

3. 染色质片段化

将提取的染色质剪切成较小的片段，理想范围在 200 - 1000bp 。常用方法有机械超声波处理或微球菌核酸酶（MNase）消化。超声波能产生随机片段，但需专用设备，且要注意控制温度等；微球菌核酸酶消化可重复性高，更适合处理多个样本，不过酶活性变化等因素可能导致结果有变异。

4. 免疫沉淀

抗体选择：挑选合适的 ChIP 验证抗体，这是实验成功的关键。对于哺乳动物样本，有多种 ChIP 级抗体可选；若靶蛋白无合格抗体，可表达 HA、myc 或 GST 等融合蛋白，再用针对亲和标记的抗体进行免疫沉淀。

孵育结合：将抗体与 Protein A/G 微珠等结合，随后与细胞裂解液孵育，形成 “微珠 - 抗体 - DNA 结合蛋白 - DNA” 复合物，从而选择性富集目标蛋白质 - DNA 复合物，去除其他无关细胞材料。

洗涤杂质：用低盐、高盐、LiCl 等洗涤缓冲液依次洗涤微珠，去除非特异性结合的杂质。

5. 解交联与 DNA 回收

解交联：通过广泛热孵育（如 62 - 65°C 孵育一定时间）或蛋白酶 K 消化蛋白质组分，断开蛋白质与 DNA 之间的交联。

DNA 回收：采用酚氯仿结合标准 DNA 纯化方法，或使用专门的纯化柱，从蛋白质片段中分离并回收 DNA 。

6. DNA 分析

运用 PCR、qPCR 或测序（如 ChIP - seq ）等技术，对回收的 DNA 进行分析，鉴定蛋白质结合的特定 DNA 区域，定量分析蛋白质 - DNA 相互作用。

关键注意事项：提升实验可靠性的细节把控

ChIP 注意事项

· 抗体选择：优先使用 ChIP 级抗体，通过 ChIP-western 验证其特异性。避免使用仅适用于 WB 或 IHC 的抗体，因其可能无法识别交联后的表位。

· 交联优化：过度交联会降低抗体结合效率，建议通过甲醛浓度梯度实验确定最佳条件。例如，某些细胞系可能需要缩短交联时间至 5 分钟。

· 片段化控制：超声功率和时间需根据细胞类型优化，避免片段过长（>1.5 kbp）或过短（<500 bp）。酶法消化（如 MNase）可产生更均一的片段，适用于低输入样本。

R-ChIP 注意事项

· RNaseH1 活性验证：确保 RHΔ 无催化活性，避免降解 RNA-DNA 杂合体。可通过体外酶切实验验证，如使用放射性标记的 RNA-DNA 底物检测切割活性。

· 背景控制：使用阴性对照（如空载细胞）排除非特异性结合，同时设置 IgG 对照组。此外，可通过 RNAse A 处理样本，验证信号是否依赖 RNA-DNA 杂合体。

· RNA 保护：全程使用 RNase 抑制剂（如 RNasin），避免 RNA 降解影响实验结果。在裂解液和洗涤缓冲液中均需添加抑制剂。

技术革新：纳米抗体赋能CHIP/R-CHIP的精准时代

传统 ChIP/R-ChIP 依赖多克隆或单克隆抗体，存在批次差异、背景高等问题。纳米抗体技术的引入彻底改变了这一局面：

√ 高特异性与亲和力：纳米抗体（如驼源 VHH 片段）体积小、结构稳定，可识别传统抗体难以结合的表位，显著降低非特异性结合。例如，Nanoselector Agarose Kit 中的纳米抗体偶联物可耐受高盐、SDS 等极端条件，适用于质谱或 Western blot 分析。

√ 偶联物优势：纳米抗体 - 琼脂糖珠偶联物结合速度快（5-30 分钟），减少孵育时间，且洗脱产物无轻重链干扰。对于微量样本（如 FFPE 组织），其灵敏度可提高 500 倍以上。

√ 实验效率提升：纳米抗体无需预清除步骤，直接加入样本即可高效捕获目标复合物，尤其适用于高通量实验。此外，其可重复性显著提高，减少实验误差。

技术应用实例：纳米抗体偶联产品在顶尖科研中的验证

值得关注的是，我们的产品Anti-GFP Magarose beads（KTSM1334）已在国际权威期刊《Nucleic Acids Research》的研究中得到成功应用。在题为《METTL3-mediated m6A modification stabilizes TERRA and maintains telomere stability》的论文中，研究团队通过 ChIP 实验揭示了 METTL3 蛋白通过 m6A 修饰调控端粒相关 RNA（TERRA）稳定性的机制。

实验中，研究者利用Anti-GFP Magarose beads高效富集了 GFP 标记的 METTL3 蛋白 - DNA 复合物，充分验证了我们产品在低丰度蛋白捕获和复杂染色质环境下特异性结合的卓越性能，为 ChIP 技术在表观遗传研究中的应用提供了重要参考。

论文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkac1027

结语

ChIP 和 R-ChIP 技术为研究染色质水平的基因表达调控提供了强有力的工具。随着纳米抗体技术的引入，尤其是高质量纳米抗体琼脂糖珠偶联物的应用，使得 ChIP/R-ChIP 实验在特异性、灵敏度和可重复性方面获得了显著提升。

我们欢迎各类科研与产业客户咨询定制化纳米抗体偶联产品，共同推动表观遗传调控研究的深入发展。

康体生命是国家高新技术企业，为客户提供包括GPCR等靶点蛋白的纳米抗体药物发现一站式CRO服务及纳米抗体等产品，至今已成功交付超1000+个项目。公司由国家长江学者、千人计划科学家领衔，技术团队由10多名医药、生物博士负责，组建有纳米抗体发现平台（噬菌体展示系统和酵母展示系统）、蛋白表达纯化平台(含大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞四大表达纯化系统)、功能验证平台、人源化及亲和力成熟平台、全自动发酵系统等。康体生命建有全球最大28000平米的羊驼实验动物基地，拥有7000平米实验室及生产车间和价值数千万元的实验、生产设备，康体生命服务的知名医药公司客户遍及中国、美国、澳大利亚、加拿大、德国、日本、韩国等国。康体生命与国内外医药企业、大学、科研机构携手并进。

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