WB化学发光（ECL）原理及常见问题分析

一、原理

   
    3-氨基邻苯二甲酰肼是一种较强的化学发光物质，在辣根过氧化物酶催化的条件下，可以被氧分子氧化成具有发光现象的中间体，当中间体从激发态返回到基态时发出光子，光子信号可通过X射线胶片或其它化学发光成像设备被捕获。常用于检测固定在膜上的蛋白质等生物大分子。

    HRP（40 kDa）已成为化学发光WB检测的常用酶。用于辣根过氧化物酶（HRP）的化学发光底物常由A、B两种液体组成；制备工作液时，需要将两种组分混合在一起。当与结合有 HRP 标记抗体（或其他探针）的印迹一起孵育时，产生 425nm 的光（如图1）。发射光只有在酶 - 底物反应期间发生；因此，一旦酶周围的底物消耗完毕，信号输出就会停止，在曝光过程中就会出现“淬灭”的现象，即发光试剂快速被消耗掉，在几秒钟内发强光，又在几秒钟内迅速消逝，导致发光信号不易被检测到。

图1 ECL化学发光原理示意图

      因此，欲得到条带清晰、背景干净的可靠WB结果，WB最后的检测步骤至关重要，由于长期使用某一种发光试剂，科研者多关注抗体因素对WB结果的影响，但是ECL化学发光试剂盒的优劣也直接影响实验结果。就抗体而言，需要保证其合适的使用浓度及特异性；对发光试剂，可以选择灵敏度高，发光稳定的试剂盒，康体生命的超敏 ECL 化学发光底物检测试剂盒（KTSM 125）灵敏度高、发光稳定，配合康体生命的重组纳米抗体（HRP标记）使用（如：Anti-Flag VHH HRP，KTSM1318），效果更佳，如图2，条带清晰可见，背景干净无杂。

图2 KTSM ECL化学发光试剂盒（KTSM 125）操作步骤，Lane 1 : Escherichia coli lysate mock transfected；Lane 2: Escherichia coli lysate transfected with C-Terminal Flag tagged protein vector；Lane 3 : Escherichia coli lysate transfected with N-Terminal Flag tagged protein vector；Lane 4 : Purified Flag tagged protein.

二、常见的问题解决方案

1、荧光淬灭

ECL发光液发光不稳定，更换优质ECL发光试剂盒（如KTSM 125）。优质的发光液还可以呈现出较低的背景，得到的数据也更可靠、漂亮。

反应体系中的HRP过少，增加HRP标记物的量。

操作时间过长，蛋白膜干掉，整个实验过程保证蛋白膜的湿润。

2、高背景

铁离子与ECL发光液中3-氨基邻苯二甲酰肼作用会发出蓝紫色荧光，所以在WB实验中避免使用金属镊子，以及生锈刀片、剪刀等裁剪转印后的膜。

封闭不完全，常选用5%BSA或脱脂奶粉，可适当增加封闭时间，对于含有生物素-亲和素系统的反应体系应避免使用脱脂奶粉封闭，因为脱脂奶粉中含有少量生物素。

抗体特异性不好，选用高质量的抗体（如康体生命重组纳米抗体）。

抗原上样量过多，减少蛋白上样量。

洗涤不充分，ECL发光前一步的洗涤步骤要充分。

3、膜上出现棕色条带 

说明反应体系中的HRP过量，稀释HRP标记物。

4、蛋白条带弱

样品蛋白丰度低，建议加大上样量。

发光液的灵敏度低，更换优质发光液，以提高条带亮度。

曝光时间太短，做实验的过程中加阳性对照，优化出合理的曝光时间。