GPCR受体技术的挑战与突破
G蛋白偶联受体（GPCRs）是细胞膜上的重要信号受体，参与了细胞感知外部信号并调控内部反应的过程。尽管GPCR在生理过程中扮演着重要角色，但它们并不是“模块化”的结构。这意味着，改变其配体特异性通常需要依赖繁琐的结构诱变和定向进化，不仅耗时长，且操作复杂。为了克服这一局限，Alice Ting教授团队利用纳米抗体设计了一种条件性自抑制结构域，通过简化GPCR的调控机制，提供了更为灵活和模块化的解决方案。
一、创新设计：条件性自抑制结构域与纳米抗体结合
这一研究的核心创新在于结合了纳米抗体和条件性自抑制结构域，使得GPCR能够根据外部信号精准激活，而无需经过传统的复杂修改。条件性自抑制结构域：研究者为GPCR设计了一个条件性自抑制结构域，位于受体的细胞外N末端，这个结构域能够使GPCR在没有外部激活的情况下保持抑制状态，从而避免受体信号的非特异性激活。
纳米抗体的引入：纳米抗体是源自骆驼科动物的小型抗体片段，具有高亲和力和小尺寸的优势。在此研究中，纳米抗体被设计并融合到GPCR的细胞外部分。这种纳米抗体与GPCR上的自抑制结构域形成了互斥关系——当特定抗原结合到纳米抗体时，抑制结构域的作用会被解除，GPCR因此被激活。
图1. PAGER的基本设计
二、多重输出：精准调控细胞行为
一旦这一合成GPCR系统（PAGER）被激活，它可以驱动多种细胞行为输出，包括：转基因表达（PAGERTF）、内源性G蛋白通路激活（PAGERG）、实时荧光监测（PAGERFL）
转基因表达系统（PAGERTF）
PAGERTF系统的目标是通过PAGER的激活驱动特定基因的表达。此系统能够在细胞中精确调控基因的开关，适用于基因功能研究和基因治疗等应用。
图2. PAGERTF系统:PAGER驱动转基因表达
当纳米抗体与特定抗原结合后，PAGER系统被激活，从而触发与转基因表达相关的调控机制。研究人员设计了与PAGER系统相连的转基因表达模块，可以在PAGER被激活时启动目标基因的表达。并且为了验证PAGER的模块化应用，研究团队将抗原结合的纳米抗体替换为针对不同抗原的纳米抗体，从而生成能够感知和响应新抗原的功能性受体。他们使用了10种GFP纳米抗体和6种mCherry纳米抗体，替换了PAGERTF中的GFP纳米抗体。结果表明，最优的抗GFP PAGERTF（包含LaG2纳米抗体）能够检测到低至1.5nM的FP，与已报道的LaG217（16–19nM）的解离常数（KD）相符；而最优的抗mCherry PAGERTF（含LaM8纳米抗体）则能检测到100nM的mCherry。这两种PAGER对其他荧光蛋白没有反应，证明了其高度的特异性。
图3. 在PAGERTF中测试多种GFP和mCherry纳米体
实时荧光系统（PAGERFL）
PAGERFL系统的目标是实现通过纳米抗体响应特定抗原时，快速并实时地监测细胞的状态变化。当纳米抗体与抗原结合时，PAGER系统被激活，并通过荧光标记物提供实时的细胞反应反馈。
图4.PAGERFL用于实时荧光检测细胞外抗原
内源性G蛋白激活系统
PAGERG系统的目的是通过激活内源性的G蛋白信号通路来调控细胞的生理过程，如增殖、分化、迁移等。通过纳米抗体结合抗原，PAGER系统被激活，从而触发G蛋白信号通路的启动。为拓展应用，研究团队探索了将抗原识别转化为内源性G蛋白通路的激活，进而调控细胞行为。通过优化，构建了PAGERGq、PAGERGs、PAGERGi和PAGERG12系统。
图5. PAGERGq、PAGERGs、PAGERGi和PAGERG12的设计和激活
研究团队对四个PAGERG系统进行了多层次的WB、BRET等实验，验证了PAGERG通过抗原识别激活内源性G蛋白通路。此外，利用AF2预测了PAGERGq的结构，揭示了肌肉毒素（MT1）自抑制作用，以及纳米抗体（蓝色）结合抗原（绿色）后解除自抑制的效果。
图6. 验证PAGERG偶联抗原识别到内源性G蛋白信号的激活
作者进一步展示了PAGERG在复杂场景下的应用：PAGERG能够调控急性脑切片和原代T细胞的多种细胞行为。综合数据表明，PAGERG可响应可溶性或细胞附着抗原，实现对神经元活性、T细胞迁移等复杂细胞行为的重编程，展现出巨大的应用潜力
图7. PAGERG在急性脑片和原代T细胞中控制多种细胞行为
