哺乳动物细胞培养指南
什么是细胞培养？
细胞培养是指将细胞从动物或植物体内取出，然后在适宜的人工环境中生长的过程。细胞可以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械方法进行解离，也可以来源于已建立的细胞系或细胞株。
原代培养
原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞，加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。
原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。严格地说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。一般持续1一4周。此期间细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。
细胞系
正常的哺乳动物细胞具有下列四大生物学特性：
锚地依赖性：细胞必须负在固体上或固定的表面才能生长分裂；
血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能正常生长；
接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制；
形态依赖性：细胞成扁平状，并有长纤维网状结构；
上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞成长。而正常细胞因某些特征的改变而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞称为细胞系。
培养基
开始工作前，请检查细胞系随附信息，以确定应使用的培养基类型、添加剂和建议。
大多数细胞系可以使用 DMEM 培养基或含 10％ 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基进行培养，并且可以根据需要添加 2 mM 谷氨酰胺和抗生素（见下表）。
使用 DMEM 培养基的一般示例：
| 培养基 | 标准量 |
| DMEM - 从 500 mL 瓶中取出 50 mL后，添加其它成分。 | 450 mL |
| 10% 胎牛血清（FBS） | 50 mL |
| 2 mM 谷氨酰胺 | 5 mL |
| 100 U 青霉素/0.1 mg/mL 链霉素 | 5 mL |
pH值
大多数正常的哺乳动物细胞系都能在pH值为7.4的环境中生长良好，而且不同细胞株间差异极小。
CO2
生长培养基可控制培养物的pH值，为培养细胞pH值的变化提供缓冲作用。通常，这种缓冲作用通过添加有机（例如HEPES）缓冲液或者CO2-HCO3-（碳酸氢盐）缓冲液实现。
培养基的pH值取决于溶解态CO2与HCO3-间的精密平衡，因此，空气中CO2含量的变化会改变培养基的pH值。为此，使用含CO2-HCO3-缓冲液的培养基时必须使用外源性CO2，特别是使用开放式培养皿培养细胞或者需要在高浓度条件下进行细胞系培养时。虽然大多数研究人员通常使用的是空气中CO2浓度为5-7%培养基，但是4-10%浓度的CO2适用于大多数细胞培养实验。
温度
细胞培养的最佳温度主要取决于分离来源的细胞宿主的体温，此外也部分受到解剖部位体温差异的影响（例如皮肤温度可能低于骨骼肌的温度）。与温度过低相比，细胞培养时温度过高是更为严重的问题；因此，往往将培养箱的温度设定为略低于最佳温度的温度。
大多数人类和哺乳动物细胞系在36°C至37°C下具有最佳生长状态。
观察细胞
每天用显微镜观察细胞，以监测其健康状况、生长速度和融合度（被单层细胞覆盖的表面积的百分比）。
贴壁细胞应主要附着在培养瓶底部，呈贴壁形态（取决于细胞系）并在其膜周围折射出光线悬浮细胞应呈圆形形态，并在其膜周围折射出光线。一些悬浮细胞可能会结团（可添加 Pluronic PF68 等解离试剂去除结团）。
含酚红的培养基应为粉红色/橙色（培养基颜色可能会随CO2环境发生变化）。成像时可使用不含酚红的培养基，避免干扰图像采集。培养基呈淡黄色表示其呈酸性且 pH 值降低，通常与受到污染或细胞不健康有关。
如果出现以下情况，请丢弃细胞：
细胞大量脱落（贴壁细胞系）和/或看起来干瘪并呈颗粒状/深色；
细胞处于静止状态（看起来根本没有生长）；
接种密度可用于确保细胞在某一特定日期适合某项实验，或保留细胞培养物以备将来使用或作为备份。悬浮细胞系根据体积进行接种，因此其接种密度以细胞数/mL 为计算单位，而贴壁细胞系则根据培养瓶表面积进行接种，因此其接种密度以细胞数/cm2为计算单位。不同的细胞系通常需要满足特定的接种密度，因此务必查看关于所用细胞系的指南。
贴壁细胞系分板时，可以使用特定的细胞系分板比或接种密度（细胞数/cm2）：
分板比为 1：2 时，融合度应达到 70-80％，并可在 1-2 天内进行实验；
分板比为 1：5 时，融合度应达到 70-80％，并可在 2-4 天内进行实验；
分板比为 1：10 时，融合度应达到 70-80％，并可在 4-6 天内进行实验；
分板比基于培养瓶表面积计算，例如：
分裂比为 1:3 时，1 x 25 cm2 培养瓶可以产出 3 x 25 cm2 培养瓶或 1 x 75 cm2
悬浮细胞系应使用特定的细胞系接种密度（细胞数/mL）进行维持：
2e5 应在 3-4 天内进行实验；
1e6 应在 1-2 天内进行实验；
如果细胞长时间无人看管（例如公共假日或周末），建议使用低于正常水平的接种密度/分板比。
更换培养基
如果细胞在几天内生长良好但尚未融合，则需更换培养基，以补充营养并维持合适的 pH 值。细胞会产生促生长因子，这些因子会被分泌到培养基中，因此更换一半培养基既能补充培养基提供的营养也能保留这些促生长因子。
传代培养悬浮细胞系
查看细胞系指南推荐的细胞分板比或传代培养细胞密度。
用移液管从培养瓶中将所需量的细胞悬液吸移至新培养瓶中。
例如：
要达到 1:2 的分裂比，需要从 100 mL 细胞悬液中吸出 50 mL。
要达到 1:5 的分裂比，需要从 100 mL 细胞悬液中吸出 20 mL。
将所需量的预热细胞培养基加入到新培养瓶中。
传代培养需要胰蛋白酶的贴壁细胞系
注意–并非所有细胞都需要胰蛋白酶化，因为胰蛋白酶化对某些细胞可能是有害的。胰蛋白酶还可能会诱使某些膜蛋白暂时内化，因此设计实验时应考虑到这一点。在这些情况下，通常可轻轻地刮除细胞或使用非常温和的消化试剂或采用其他替代方法。
准备就绪后，小心地将装有所需细胞的培养瓶中的培养基倒入废液罐（盛有约 100 mL 10％ 次氯酸钠），注意不要滴落，以免增加污染风险。
利用无菌技术，将足量的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）倒入/移液至培养瓶中，以洗涤细胞并完全除去残留培养基中的胎牛血清（FBS）。轻轻摇动几次培养瓶，以冲洗细胞，然后小心地将无菌 PBS 倒回/移液至废液罐中。
必要时可以重复一到两次（某些细胞系进行胰蛋白酶消化的时间较长，并且需要多次冲洗才能彻底去除残留的 FBS，从而促进胰蛋白酶化）。
用移液管加入足量的胰蛋白酶-EDTA溶液，以覆盖培养瓶底部的细胞。
例如：
在 25cm2 培养瓶中，加入约 1 mL 胰蛋白酶- EDTA溶液。
在 75 cm2 培养瓶中，加入约 5 mL 胰蛋白酶-EDTA溶液。
在 175 cm2 培养瓶中，加入约 10 mL 胰蛋白酶-EDTA溶液。
轻轻转动培养瓶，确保胰蛋白酶与所有细胞接触。将培养瓶放入 37 ℃ 培养箱中。不同细胞系的胰蛋白酶化时间不同。为了避免因过度胰蛋白酶化而严重破坏细胞，必须每隔几分钟进行一次检查。
细胞脱离后（可能需要轻轻敲击几下培养瓶），立即向培养瓶中添加一些培养基（培养基中的 FBS 会使胰蛋白酶失活）
按照所需的分板比，用移液管从该细胞悬液中将所需体积的细胞吸移到新培养瓶中。然后向这些培养瓶中添加培养基至所需体积。
例如：
在 25cm2 培养瓶中，加入约 5-10 mL 培养基。
在 75 cm2 培养瓶中，加入约 10-30 mL 培养基。
在 175 cm2 培养瓶中，加入约 40-150 mL 培养基。
放置细胞过夜，使细胞恢复并重新贴壁。更换培养基，以彻底清除残留的胰蛋白酶。
请始终用70%乙醇擦拭双手和工作区；
将容器、培养瓶、培养板和培养皿放入细胞培养通风橱之前，先用70%乙醇擦其外部；
不要直接从试剂瓶或培养瓶中倾倒培养基和试剂；
使用无菌玻璃或一次性塑料移液管和移液器操作液体时，每只移液管只能使用一次，以避免交叉污染，无菌移液管到使用时才能打开其包装，移液管应存放在作区内；
试剂瓶和培养瓶使用后应盖上盖子，多孔板应用胶带密封或放入可重复密封的袋中，以防止微生物和悬浮污染物进入；
无菌培养瓶、试剂瓶和培养皿等到使用时才能打开盖子，不得将其开放暴露在境中，使用后，应立即盖好盖子；
盖子取下后，必须开口朝下放置在工作台面上；
必须使用无菌的玻璃器皿和其他设备；
进行无菌操作时，不要交谈、唱歌或吹口哨；
尽可能快速地进行实验，以降低污染风险；
