康体生命新产品-直标VHH抗体一步法Western Blot介绍
Western blotting，又称蛋白免疫印迹，是一种广泛应用的分子生物学技术，主要用于检测、分析和定量复杂生物样本（如细胞裂解液、组织匀浆、血清、尿液等）中特定蛋白质的存在、表达水平以及可能的修饰状态。
01 基本原理
Western blot的核心原理是利用抗原-抗体特异性结合的原理，结合蛋白质电泳分离技术和固相免疫检测技术，实现对目标蛋白质的定性、定量分析。传统WB步骤分为电泳-转膜-封闭-一抗孵育-洗一抗-二抗孵育-洗二抗-曝光八个实验步骤，需要1-2天才能完成实验流程，康体生命推出的直标标签纳米抗体（Anti-tag VHH-HRP）系列产品，只需一步抗体孵育，能有效减少实验时间，最快半天可完成WB实验，大大提高实验效率。
适用场景：用Western Blot检测带有标签（HA、MYC、FLAG、MBP、GST、Strep-Tag II，GFP，Mcherry）的融合蛋白。
适用产品：Anti-tag VHH-HRP、Anti-tag VHH-Biotin预混SA-HRP。
02 具体步骤
1. 蛋白提取与定量：首先从样本中提取总蛋白质，通常采用适当的裂解缓冲液破坏细胞结构并释放蛋白质，然后通过BCA法、Bradford法或Lowry法等进行蛋白质浓度测定。
2. 电泳分离：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）依据蛋白质的相对分子质量（MW）进行分离，样本中的蛋白质在电场作用下按照大小分布于凝胶的不同位置。
ØTips：电泳时间大约1.5h内
3. 转膜：电泳后的凝胶通过电转移系统将分离好的蛋白质转移到一种疏水性的固相支持物（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上，形成“蛋白质印迹”。
ØTips:转膜时间约0.5h，根据蛋白大小、转膜方式等调整时间
4. 封闭：为了减少非特异性结合，用含一定浓度的非离子型洗涤剂（如Tween-20）和蛋白质（如BSA或脱脂奶粉）的缓冲液对膜进行封闭。
ØTips：可用含5%脱脂奶的TBST/PBST封闭，或选择商用封闭液，封闭时间2h，或者4℃过夜，延长封闭时间可以减少背景
加入一抗（针对目标蛋白质的特异性抗体）孵育，使一抗与膜上的目标蛋白结合。
5.抗体孵育：倒掉封闭液，加入稀释好的VHH直标抗体，室温孵育2h，回收抗体再利用，用TBST或PBST等buffer洗去未结合的一抗。
ØTips：抗体孵育时间1-2h，也可4℃过夜孵育，孵育时间过长的话可能导致非特异性结合，为了背景干净，可曾加洗抗体次数
6. 信号检测与分析：根据标记物类型选择相应的检测方法。对于HRP酶标记，常用化学发光法（ECL）或染料显色法（如DAB）；对于荧光标记，可直接进行荧光成像。通过成像设备记录并量化信号强度，对应到蛋白质的位置（分子量），从而确定目的蛋白的存在及其相对含量。
ØTips:曝光时间可以多尝试，发光弱后可以再次添加发光液重新曝光
二、应用领域
1. 基因功能研究：通过比较不同处理条件下（如野生型与突变型、药物处理前后、正常与疾病状态等）目标蛋白的表达变化，揭示基因调控机制或蛋白功能在特定生理或病理过程中的作用。
2. 疾病诊断与监测：检测病患体液或组织中特定疾病标志蛋白的表达水平，如癌症相关抗原、炎症因子、自身免疫疾病的抗体等，辅助疾病诊断、预后评估或治疗效果监测。
3. 药物筛选与药效评价：评估候选药物对靶蛋白表达或活性的影响，作为药物作用机制研究和药效评价的重要手段。
4. 抗体验证：确认抗体对目标蛋白的特异性和敏感性，用于优化实验条件、确保后续实验结果的可靠性。
5. 蛋白修饰研究：通过使用特异性识别磷酸化、乙酰化、泛素化等修饰形式的抗体，检测蛋白质翻译后修饰状态的变化，探究其在细胞信号传导、蛋白质稳定性调控等方面的功能。
6. 蛋白质纯度鉴定：对纯化得到的重组蛋白进行Western blot分析，确认其纯度及正确分子量，为后续的结构功能研究提供保证。
03 应用领域
1. 基因功能研究：通过比较不同处理条件下（如野生型与突变型、药物处理前后、正常与疾病状态等）目标蛋白的表达变化，揭示基因调控机制或蛋白功能在特定生理或病理过程中的作用。
2. 疾病诊断与监测：检测病患体液或组织中特定疾病标志蛋白的表达水平，如癌症相关抗原、炎症因子、自身免疫疾病的抗体等，辅助疾病诊断、预后评估或治疗效果监测。
3. 药物筛选与药效评价：评估候选药物对靶蛋白表达或活性的影响，作为药物作用机制研究和药效评价的重要手段。
4. 抗体验证：确认抗体对目标蛋白的特异性和敏感性，用于优化实验条件、确保后续实验结果的可靠性。
5. 蛋白修饰研究：通过使用特异性识别磷酸化、乙酰化、泛素化等修饰形式的抗体，检测蛋白质翻译后修饰状态的变化，探究其在细胞信号传导、蛋白质稳定性调控等方面的功能。
6. 蛋白质纯度鉴定：对纯化得到的重组蛋白进行Western blot分析，确认其纯度及正确分子量，为后续的结构功能研究提供保证。
综上所述，Western blot作为一种成熟且灵活的技术平台，在生物医学研究、临床诊断、药物开发等领域具有广泛的应用价值，为深入理解蛋白质在生命过程中的角色提供了关键信息，康体生命提供的直标标签纳米抗体能节约实验时间，助力科研发展。
