半衰期灵活可调的纳米抗体
前言
纳米抗体作为一类具有很好应用前景的抗体类型，在很多疾病的诊断和治疗方面具有优势。然而，其血浆内半衰期短的特点限制了其在治疗领域的应用。半衰期是指从注射完毕开始计算，到血浆中药物浓度降至一半所需的时间（图1）。本文将探讨如何调控纳米抗体的半衰期，以提高其在治疗领域的应用价值。
图1. 半衰期示意图 [1]
纳米抗体相较于传统抗体，为何半衰期更短？
纳米抗体半衰期短的原因主要有两个：
1、肾小球滤过作用导致纳米抗体快速从体内清除，肾小球过滤蛋白药物的界限一般在60kDa左右，也就是说，小分子量的抗体片段或衍生物，如纳米抗体（15kDa）和scFv（28kDa）甚至Fab（50kDa），都会通过肾小球的滤过作用从体内清除，导致其具有较短的半衰期。其中，纳米抗体在所有抗体类型中分子量最小，半衰期往往只有几十分钟。
2、纳米抗体缺乏特异性与FcRn结合的能力，传统抗体的半衰期通常较长，因其分子量较大，且能够特异性地与FcRn（neonatal Fc receptor，新生儿Fc受体）结合。FcRn能够保护抗体不被溶酶体降解，随后抗体随FcRn转运至细胞膜表面失去与FcRn结合，重新释放进入血浆，从而延长了抗体的半衰期（图2）[2]。
图2. FcRn帮助抗体延长半衰期的机制[2]
调控纳米抗体半衰期的策略
1、增加分子量：通过融合蛋白,如HSA等，或多聚体结构增加纳米抗体的分子量，降低肾脏清除速度；
2、与Fc片段结合：将纳米抗体与Fc片段结合，以借用FcRn的功能延长其半衰期；
3、聚乙二醇化（PEGylation）：通过聚乙二醇修饰纳米抗体，以延长其在体内循环的时间；
4、脂质体包裹：通过纳米技术将纳米抗体包裹在脂质体内，以提高其稳定性和延长半衰期。
目前，进入临床或已上市的纳米抗体药物主要采用了融合Fc、HSA或HSA纳米抗体的方式来延长半衰期。
实例1——通过融合抗HSA纳米抗体延长半衰期
1、HSA的特点
图3. HSA的X射线晶体结构（PDB ID: 1uor）
HSA（人血清白蛋白）是人体血浆中含量最丰富、结构最稳定的蛋白质，含有585个氨基酸，分子量约为66.5 kDa。HSA的X射线晶体结构（图3）表明它是一个心形分子,主要由α-螺旋结构组成，缺乏β-折叠。它含有三个同源结构域DI、DII和DIII，每个结构域又分为A和B子结构域（DIA、DIB、DIIA、DIIB、DIIIA和DIIIB）。这些结构域通过长且灵活的环连接。HSA的血浆浓度为约45 mg/ml (0.6 mM)，循环半衰期长达20天。当纳米抗体与HSA结合时，它们的流体力学半径和分子量会增加，肾小球过滤减少，体内滞留时间将大大延长。
2、Ozoralizumab
图4. Ozoralizumab结构示意图
目前，已有许多抗肿瘤靶点的纳米抗体与抗HSA纳米抗体的双特异性纳米抗体被报道。其中，Ablynx开发的人源化、三价的双特异性纳米抗体Ozoralizumab（英文商品名：Nanozora®）在2022年9月于日本获批上市，可用于治疗类风湿关节炎 (RA) 等疾病，这也是全球首款获批的双特异性纳米抗体[3]。Ozoralizumab（图4）分子量为38 kDa, 包含3个纳米抗体结构域，其中2个靶向TNF-α的不同表位，1个靶向HSA，以延长药物半衰期。单次给药后，Ozoralizumab的平均半衰期t1/2为18.2天。
3、JS014
君实生物自Anwita Biosciences引入了一种创新型纳米抗体JS014，该药物的活性成分为重组白介素21和抗HSA纳米抗体融合蛋白。JS014具有高亲和力和特异性，可以选择性地结合人IL-21R并激活淋巴细胞。通过融合抗HSA的单域抗体，JS014成功延长了IL-21的半衰期。目前，JS014正在进行晚期恶性肿瘤的临床试验。
实例2——通过与Fc片段结合延长纳米抗体半衰期
1、Fc片段的特点
抗体Fc片段是抗体的常数区，其中氨基酸序列在不同类型的抗体中保持不变。抗体类型由FC片段的特异性结构来决定。与单克隆抗体不同，纳米抗体由于缺乏Fc片段，因此无法实现抗体依赖的细胞介导的细胞毒（ADCC）效应和血清稳定性，这些效应需要Fc受体的参与。在自然杀伤细胞（NK）介导ADCC作用中，Fc受体FcγRIIIa（CD16a）发挥着关键作用。通过将纳米抗体与Fc片段的重组人源化重链抗体形式结合，可以增加其Fc介导的效应功能和血液滞留时间，但也会降低其扩散优势。选择IgG1 Fc作为纳米抗体的融合片段，是因为IgG1与Fc受体蛋白亲和能力。
2、KN035
图5. KN035晶体结构
康宁杰瑞开发的恩维达®（KN035）是一种应用Fc融合技术最成功的纳米抗体药物。该药物是康宁杰瑞自主研发的PD-L1单域抗体Fc融合蛋白，作为全球第一个获批上市的皮下注射PD-(L)1抗体，适用于成人晚期实体瘤中不可切除或转移性微卫星高度不稳定（MSI-H）或错配修复基因缺陷型（dMMR）的治疗。KN035的Fc片段可以使纳米抗体形成二聚体，并且延长分子的体内半衰期至约200小时。因此，KN035具有长效性和高度特异性，是一种具有极高临床应用价值的新型抗体药物。
3、HLX53
图6. HLX53的结构及作用机制示意图
复宏汉霖宣自主研发的HLX53是一种创新型纳米抗体药物[4]，由TIGIT的纳米抗体和野生型IgG1的Fc端组成（图6）。TIGIT是一种免疫检查点分子，可抑制T细胞的活化和增殖，从而降低免疫系统对肿瘤细胞的攻击。HLX53采用Fc融合技术，具有长效性、高度特异性和稳定性，可通过静脉注射或皮下注射等方式给药。2022年12月9日，HLX53在晚期/转移性实体瘤及淋巴瘤患者中开展的I期临床试验完成首例受试者给药（NCT05394168）。临床前研究结果表明，HLX53具有优异的肿瘤抑制效果且安全性良好，HLX53具有潜在的治疗多种癌症的临床应用价值。目前，全球范围内尚无同类抗TIGIT的Fc融合蛋白药物获批上市。
实例3——多价纳米抗体（ES102）
图7. ES102结构示意图[5]
多价纳米抗体具有更大的分子量，能够有效抵抗肾小球的滤过作用。科望生物的第二款抗体药物OX40抗体ES102（图7）已经申请临床试验，并已经获得中国国家药品监督管理局的受理。ES102是继信达生物IBI101、丽珠单抗、恒瑞医药SHR-1806之后第四款申请临床试验的OX40抗体。ES102是一种六价纳米抗体的Fc融合蛋白，通过独特的设计，即使没有外源性交联，也能够强力激活OX40通路。据报道，相比传统的二价或四价OX40抗体，ES102具有更强的免疫激活能力，并已经显示出显著的单药及联合免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1抗肿瘤药效。同时，在临床前的安全性评价中，ES102也展现了良好的安全性特征。目前，ES102正在进行临床I期试验(NCT04991506 & NCT04730843)。
实例4——通过聚乙二醇化（PEGylation）延长纳米抗体半衰期
1、PEG的特点
图8. 聚乙二醇（PEG）的结构及PEG化的优势[6]
聚乙二醇（Polyethylene glycol，简称PEG）由乙二醇聚合形成，属于聚醚类物质，具有较好的水溶性，极低的免疫原性和毒性。PEG化修饰是指将药物与PEG共价结合，以改善药物的药代动力学、药效学和免疫学特性，提高其治疗效果（图8）。PEG化修饰可以改变药物的物理化学性质，增强药物在体内的保留时间，延长半衰期，提高细胞受体结合亲和力，从而提高肿瘤靶向性，降低不良事件发生率。PEG还可以提高蛋白质的溶解度和稳定性，有助于药物的生产和储存。因此，PEG被广泛应用于药物传递和药物修饰技术中，可以直接与药物偶联，或附着在药物表面一起封装于纳米材料中。
2、ATN-192
Ablynx开发的ATN-192是第二代TNFα纳米抗体，即PEG修饰的长效版本，是在Ozoralizumab的基础上开发而来的。目前，ATN-192已经完成了一期临床试验。
小结
纳米抗体由于分子量小，半衰期短，限制了其在临床应用中的表现。因此，调控纳米抗体的半衰期对于拓展其在治疗领域的应用具有重要意义。目前，已经有许多方法可以有效地提高纳米抗体的半衰期，如增加分子量、与Fc片段结合、融合载体蛋白或抗HSA纳米抗体、聚乙二醇化和脂质体包裹等。部分方法已经进入临床试验阶段或已获批上市，我们期待更多的纳米抗体药物能够推向临床并且上市，推动人类健康事业的发展。
[1] https://www.youtube.com/watch?v=HAaj6Lb46o4 & https://www.medicineslearningportal.org/2015/07/drug-handling-introduction.html
[2] Low-Marchelli, J. Quick Facts to Improve Antibody Half-Life Measurements.
[3] Coppieters, K. et al. Formatted anti–tumor necrosis factor α VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen‐induced arthritis. Arthritis & Rheumatism 54, 1856-1866 (2006).
[4] Hua, B. et al. A novel single domain antibody targeting TIGIT for cancer use in combination therapies. Cancer Research 81, 2451-2451 (2021).
[5] https://posts.careerengine.us/p/61b402d913cf194b25c5a79d
[6] https://biopharmaspec.com/biopharmaceuticals/pegylated-proteins/
